Buzilgan kameralar haqida tez-tez so'raladigan savollar

E. E. coli xorijiy proteinni ifodalaydi. Sonicated bo'lsa, u 1% triton-X-100 o'z ichiga olgan PBS ichida to'xtatiladi. Ultratovush effekti yaxshiroq. 1% triton-X-100 ta'siri hali ham aniq. Streptomyces kabi boshqa bakteriyalar ham ishlaydi. Rekombinatlangan oqsilni ifodalagandan so'ng hujayralar ultrasonik hujayra buzilishi bilan buzilgan, 400w muz hammom yordamida buzildi va 1s uchun 2s ezilgan, ammo qisqa vaqt ichida katta miqdorda ko'pik hosil qilindi, bu esa ezilgan quvvatga ta'sir etdi. Ikkala pb va tris tamponlar ham shunga o'xshash edi. Parchalanish tugatilmaganmi va maqsadli protein bu buzilmagan hujayralardadir, nima qilishim kerak?

Tahlil: Probning joylashuvi yaxshi joylashtirilmaganligi sababli hosil bo'ladi; prob taxminan 0,5-1 sm ga yaqin bo'lishi kerak; quvvat asbobga ko'ra farq qiladi, lekin suyuqlik darajasi kuzatilishi mumkin, dalgalanma bor, lekin juda kuchli emas; siz ultrasonik hujayralarni tanlashingiz mumkin. Crusher 10s uchun 3s uchun buzilgan va 20-30 marta sinadi. Shoxning pozitsiyasi ham e'tiborga olinishi kerak. Ovoz noto'g'ri bo'lsa, u vaqtni belgilash kerak; bakteriyalarning kontsentratsiyasini hisobga olgan holda. Zaryadsizlanadigan hajmni oshirishga harakat qiling, Zu'ning kuchi 60% dan oshmasligi kerak; 8s uchun 8sni sindirishga harakat qiling, ayrim bakterial oqsillarga proteinni denatürasyona sabab bo'lish uchun proteini yutib yuborish qiyin, va bu biroz vaqtga to'xtatilishi mumkin bo'lgan kabarcıklar ishlab chiqaradi. Qolgan organlar shaklida topilgan oqsil.

Streptomyces (aktinomisetlar) ning sonikatsiyasi uchun qanday sharoitlar mavjud?

Analitik: Prokaryotik tizimning filogenetik daraxti bo'yicha prokaryotlarga xos molekulyar va biologik xususiyatlarga ega bo'lgan Gram-musbat (Eubacteria) dallanma guruhining (G + C) molyar ulushiga (mol%) tegishli aktinomitsalar kiradi. Biroq, uning turli guruhlarida hujayra devorining kimyoviy tarkibi katta farq qiladi. E. coli ultratovushda 400 Vt ishlatiladi va 5s 5sni buzish usuli samarali, ammo u Streptomycesda qo'llaniladi va hujayra devorining tuzilishidagi farqning ta'siri yo'q. Streptomyces (actinomycetes) ning oldingi spinlash usuli odatda bakterial suspenziya muayyan konsentratsiyasiga moslashtiriladi. Ultrasonik hujayra to'xtatuvchisi yordamida maydalashning o'ziga xos shartlari quyidagilardir: 24 soatlik madaniy eritmada bakteriyalar yig'ilib 5 minut davomida 5 minutda hujayralarni to'plash; pH 7.5 Na2HPO -NaH2PO buferini 3 marta yuvish va keyin hujayralar tampon yordamida 1: 3 bakterial suspenziyaga shakllantirish qilingan. 40 ml katta plastmassa sinov naychasidan joylangan; katta plastmassa sinov naychasini muz hammomiga joylashtiring va uni ultrasonik hujayra buzuvchi (kuch, 200W, 1/2 "prob, 30s uchun kesish, 30s kesish) bilan maydala, 12 000 r / hujayra zahiralari va supernatantlarni to'plash, yuvish xujayralari bir marta pH 8 da oldin sovutilgan sho'r yoki Tris-HCl bilan yuvilishi mumkin. Bundan tashqari, ultratovush dozasi namunalar va bakteriyalar miqdori bilan juda o'zgarib turadi, 600w, 5s uchun ezilgan, 5s uchun to'xtab, muz hammom va 1 mm PMSF yakuniy konsentratsiyasi qo'shiladi.Ultrasonik zo'ravonlik va chastotani aniqlash uchun bakteriyalarni istalgan vaqtda butunlay sindirilmasligini tekshirish kerak.